Was ist Dunkelfeldmikroskopie?

Die Dunkelfeldmikroskopie ist eine Methode, welche meist in der Durchlichtmikroskopie eingesetzt wird, aber auch bei Auflichtmikroskopen funktioniert. Diese Methode der Lichtmikroskopie ist seit über 250 Jahren bekannt und war lange Zeit eine extrem wichtige Methode zur Verstärkung des Kontrasts bei schwer sichtbaren Objekten.

Unterschied zwischen Hellfeld- und Dunkelfeldmikroskopie

Wenn man typischerweise in ein Durchlichtmikroskop schaut erscheint der Hintergrund komplett hell und das Objekt, welches man untersucht, hebt sich dunkel mit verschiedenen Kontrast-Werten von diesem Hintergrund ab. Bei der Dunkelfeldmikroskopie ist es genau andersherum. Dort ist der Hintergrund komplett schwarz („dunkel“) und das Objekt hebt sich mit seinen Strukturen hell vom Hintergrund ab.

Um zu verstehen wie die Dunkelfeldmikroskopie funktioniert muss man wissen, dass von Licht bestrahlte Objekte die Lichtstrahlen sowohl absorbieren aber auch ablenken können. Bei der Hellfeldmikroskopie macht man sich die absorbierende Eigenschaft zu Nutze: Indem das Objekt bestimmte Lichtstrahlen absorbiert gelangen diese nicht bis zum Objektiv und „fehlen“ dort.

Die Lichtstrahlen, die nicht absorbiert wurden und am Objekt vorbeigehen gelangen allerdings bis zum Objektiv und bilden damit quasi den hellen Hintergrund. Durch die Absorption hebt sich das Objekt dann dunkel von dem hellen Hintergrund ab.

Dieses Prinzip funktioniert bei relativ dichten und dicken Objekten auch sehr gut, jedoch wird es problematisch wenn man sehr dünne, fast durchsichtige Objekte beobachten möchte. Bei diesen ist das Problem, dass sie nicht in der Lage sind genügend Licht zu absorbieren wodurch sie mit extrem geringem Kontrast abgebildet werden.

Hellfeld vs. Dunkelfeld

Genau an diesem Punkt setzt die Dunkelfeldmikroskopie ein und macht sich die ablenkende Eigenschaft von Objekten zu Nutze. Bei dem Dunkelfeld werden die Lichtstrahlen so ausgerichtet bzw gebrochen, dass sie zwar das Präparat bestrahlen, nicht aber auf normalem Wege das Objekt erreichen würden.

Aus diesem Grund bleibt der Hintergrund erstmal komplett schwarz bzw. dunkel, da keine Lichtstrahlen das Objektiv erreichen. Allerdings verfehlen nicht alle Lichstrahlen das Objektiv, sondern diejenigen, die auf das Präparat treffen, werden abgelenkt und gelangen so trotzdem zum Objektiv.

Aus diesem Grund ist der Hintergrund dann komplett dunkel, das Objekt aber hebt sich hell und kontrastreich vom Hintergrund ab. Der Vorteil dieser Methode ist, dass es viel leichter ist, starke Kontraste zu erzeugen, weil sich schon ein schwaches Licht auf einem komplett dunklen Hintergrund gut abhebt.

Außerdem lenken selbst Teilchen, welche kleiner als die Auflösungsgrenze des Mikroskops sind Lichtstrahlen ab, sie würden diese allerdings nicht absorbieren. Durch diese Tatsache eignet sich Dunkelfeld nicht nur um den Kontrast zu steigern sondern auch um kleinste Teilchen sichtbar zu machen, welche bei normaler Hellfeldmikroskopie schon aus physikalischen Gründen nicht sichtbar wären.

Dunkelfeldmikroskopie bei Stereomikroskopen

Bisher haben wir das Dunkelfeldprinzip nur bei Durchlichtmikroskopen betrachtet, es lässt sich allerdings auch bei Auflichtgeräten benutzen. Will man Dunkelfeld bei der Auflichtmikroskopie einsetzen, so kommt es entscheidend darauf an, von wo die Lichtquelle das Objekt bestrahlt. Der Lichteinfall entscheidet dabei ob das Objekt hell (Hellfeld), oder dunkel (Dunkelfeld) abgebildet wird.

Bestrahlt man das Objekt jedoch flach von der Seite, so wird der Großteil der Lichtstrahlen nur unter einem kleinen Winkel reflektiert und erreicht dadurch nicht das Objektiv. Lediglich ein kleiner Teil wird durch die Oberflächenbeschaffenheit stärker gebrochen und kann dadurch das Objektiv erreichen.

Dies kann man sich bei der Beobachtung von Oberflächen zu Nutze machen, da man dadurch Kratzer oder Unebenheiten sofort erkennen kann, was bei Hellfeld um einiges schwieriger wäre. Die glatten Oberflächen reflektieren das Licht nämlich sauber unter einem kleinen Winkel, wodurch diese dunkel erscheinen. Die Kratzer jedoch brechen das Licht viel stärker und erscheinen dadurch hell und sind somit einfach ausfindig zu machen.